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Séquençage à haut débit - discussion<br>A discussion of shotgun sequencing DNA from maternal blood
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Commentaires sur les études
Étude de Fan et al.
Fan et al ont récemment proposé le diagnostic d'aneuploïdie foetale par séquençage à haut débit. Cette technique permet de séquencer plusieurs milliers à plusieurs millions de fragments d'un génome en même temps. Elle repose sur la création d'une banque de fragments constituée de façon aléatoire par fragmentation de l'ADN total plasmatique non pre-amplifié. Les fragments sont ensuite liés à des adaptateurs universels et fixés sur un canal du séquenceur puis amplifiés par cluster et séquencés. Les fragments séquencés sont ensuite analysés et comparés aux séquences chromosomiques de référence. Ceci pourrait permettre d'analyser la quantité d'ADN provenant du chromosome surnuméraire, sans nécessité de différencier l'ADN maternel de l'ADN foetal.
Les auteurs décrivent l'analyse de 9 cas de trisomie 21, 2 cas de trisomie 18, un cas de trisomie 13 et 6 cas avec foetus normal. Le résultat du diagnostic par la méthode invasive est connu par les auteurs avant la réalisation de l'étude. L'application du séquençage à haut débit à l'ADN plasmatique libre collecté après la manoeuvre invasive chez les 18 cas mentionnés conduit à un diagnostic correct dans tous les cas.
Si cette approche semble très attractive, plusieurs interrogations peuvent être posées suite à la lecture du travail scientifique, à la fois sur la méthodologie, l'analyse statistique et l'évaluation des résultats.
Concernant la méthodologie, il faut mentionner le problème de la quantité d'ADN foetal libre présent dans le plasma de toutes les femmes enceintes et qui pourrait limiter la faisabilité du test. Fan et al. effectuent leur analyse sur le plasma collecté après le prélèvement invasif des cellules foetales, une manoeuvre connue pour être susceptible de diffuser davantage d'ADN foetal dans le sang. Ils ne se placent donc pas dans les conditions de réalisation d'un test non invasif à but diagnostic. Dans la Figure 2 de l'article, le cut off est placé de façon erronée pour l'évaluation d'un test diagnostic (étant donné que les auteurs utilisent une formule de calcul de l'IC (Intervalle de Confiance) sur la moyenne alors que, pour un test diagnostic il faut utiliser la formule pour l'IC sur les individus). Le vrai cut off serait autour de 1,045 (au lieu que 1), ce qui implique que la quantité d'ADN foetal indispensable pour réaliser ce test est autour de 9%, au lieu de 2% comme indiqué dans la légende de la figure.
L'étude des « supplementary data » montre par ailleurs que les auteurs détectent des quantités d'ADN foetal très variables et dont la quantité varie largement selon la méthode de quantification. Les auteurs signalent qu'ils obtiennent par leur méthode 10 millions de séquences tag de 25 bp, mais que seulement 50% de ces séquences sont utilisables car elles correspondent à des séquences uniques et représentent 4% du génome. Le nombre de séquences tag qui mappent au chromosome 21 est donc déterminant de la capacité du test à réaliser le diagnostic car, dans le cas favorable où l'ADN foetal libre représenterait 10% de tout l'ADN libre plasmatique, l'ADN du chromosome 21 surnuméraire représenterait uniquement 0,21% de tout l'ADN et la distinction entre diploïdie 21 et trisomie 21 dans l'ADN foetal serait fondée sur la capacité à distinguer 4,55% d'ADN du chromosome 21 (par rapport à l'ADN total) en cas de trisomie de 4,34% du même ADN en cas de foetus normal. Cette capacité de distinction est clairement relative au nombre de tags obtenus. Les auteurs ne précisent pas ce nombre dans les cas de trisomie 21 par rapport aux cas sans trisomie 21.
Enfin, cette étude se place dans une étude de phase 1 selon la classification des phases de validation proposée par
Sackett, ce qui n'autorise pas l'utilisation du terme « diagnostic » dans le
titre de l'article, car les auteurs connaissaient le résultat avant la réalisation des tests.
Fan et al have recently proposed the diagnosis of fetal aneuploidy by high speed sequencing. This technique permits the sequencing of several thousand to several million fragments of a genome at the same time. It is based on the creation of a bank of fragments constituted randomly by fragmentation of total non pre-amplified plasmatic DNA. The fragments are then linked to universal adaptators and fixed on a canal of the sequencer, then amplified by cluster and sequenced. The sequenced fragments are then analysed and compared with the reference chromosomic sequences. This could allow the analysis of the amount of DNA stemming from the supernumerary chromosome, without the necessity to differentiate maternal DNA from fetal DNA.
The authors describe the analysis of 9 cases of trisomy 21, 2 cases of trisomy 18, 1 case of trisomy 13 and 6 cases with normal fetus. The result of the diagnosis with the invasive method is known by the authors before performing the study. The application of high speed sequencing to the free plasmatic DNA collected after the invasive operation in the 18 cases mentioned leads to a correct diagnosis in all cases.
Although this approach may seem very attractive, several questions can be raised following the reading of the scientific work, with respect to methodology, statistical analysis and the evaluation of results.
Regarding the methodology, the problem may concern the amount of free fetal DNA present in the plasma of all pregnant women, as it can be in very low and could limit the feasibility of the test. Fan et al. perform their analysis on the plasma collected after the invasive sampling of fetal cells, an operation known for being likely to disseminate more fetal DNA in the blood. They do not therefore place themselves in the conditions of creating a test for non invasive diagnosis. In Fig. 2 of the article, the cut off is placed erroneously for the evaluation of a diagnostic test, since the authors use an IC calculating formula (Confidence Interval). The real cut off should be around 1,045 (instead of 1), implying that the amount of fetal DNA required to achieve this test is around 9 %, instead of 2 % as indicated in the figure legend.
Besides, the study of “supplementary data shows that the authors detect very variable quantities of fetal DNA, which largely vary according to the quantification method. The authors claim that with their method they obtain 10 million tag sequences of 25 bp, but that only 50 % of these sequences are usable as they correspond to unique sequences and represent 4 % of the genome. The number of tag sequences mapping to chromosome 21 is therefore determinant of the capacity of the test to achieve the diagnosis since, in the favourable case where free fetal DNA would represent 10 % of all plasmatic free DNA, the DNA of the supernumerary chromosome 21 would represent only 0,21 % of all DNA, and the distinction between diploidy 21 and trisomy 21 in fetal DNA would be based on the capacity to distinguish 4,55 % of chromosome 21 DNA (as compared to total DNA) in case of trisomy, and of 4.34 % of the same DNA in case of normal fetus. This capacity of distinction clearly depends on the number of tags obtained. The authors do not give this figure in the cases of trisomy 21 as compared to the cases without trisomy 21.
Finally, this survey is a phase 1 study according to the classification of validation phases proposed by Sackett, which does not authorise the use of the term “diagnosis in the title of the article, since the authors know the result before performing the tests.
Coût du test proposé par Fan et al. / Cost of the test proposed by Fan et al.
[...] they obtained on average 5 million sequence tags per patient sample using Solexa machines. In a Solexa machine there are 8 "sequencing lanes", each one is capable to produce 5 to 10 million reads. I suppose that they were using one lane per sample; so the price of sequencing of one sample can be around one eighth of the price of a run.
Just for information, I am giving you the price of a run in our laboratory. One run costs roughly 7000 € (without VAT) but you should add the price of the library construction which is about 350 € (without VAT). So, if you are sequencing 8 samples, the total is (8 x 350 =) 2800 € + 7000 € = 9800 € (without VAT). It means 1225 € per sample. (For the time being (!) and it is at cost for us - since the prices are constantly changing.)<br><br>Gabor GYAPAY, Genoscope
Tableau comparatif des méthodes de diagnostic prénétal des maladies et anomalies génétiques
(Décembre 2012)
Articles
- H. Christina Fan, Yair J. Blumenfeld, Usha Chitkara, Louanne Hudgins, and Stephen R. Quake. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proceedings of the National Science Academy of the USA, 2008, 105, 16266-71.
http://afar.info/id=2248 - Rossa W.K. Chiu, K.C. Allen Chan, Yuan Gao, Virginia Y.M. Lau, Wenli Zheng, Tak Y. Leung, Chris H.F. Foo, Bin Xie, Nancy B.Y. Tsui, Fiona M.F. Lun, Benny C.Y. Zee, Tze K. Lau, Charles R. Cantor, Y.M. Dennis Lo. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. PNAS December 23, 2008, vol. 105 no. 51 20458-20463.
http://afar.info/id=2318 - Though Sequencers Improve Performance, $10,000 Genome Remains Elusive in '08, Survey Finds. Genomeweb Newsletter, January 13, 2009. Full text
Modif. December 09, 2012, at 08:33 AM<br />(:addThis username="xa-4b5388e32c732dfe" btn="lg-share":)
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