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Septembre 2007

Méthode ISET de Diagnostic Prénatal sans risque de fausse-couche : Historique

Prof. Patrizia Paterlini-Bréchot
Directeur Unité INSERM 807
Faculté de Médecine Necker-Enfants Malades
Paris

Le prestigieux National Institute of Child Health américain avait financé à la hauteur de plusieurs dizaines de millions de dollars une étude multicentrique (9 centres académiques) quinquennale pour valider une nouvelle méthode de Diagnostic Prénatal Non Invasif, c'est-à-dire sans risque de fausse-couche : un effort à la hauteur du défi. Les Etats-Unis voulaient ainsi être le premier Pays au monde à avoir franchi une étape clé du progrès de la médecine moderne : la possibilité d'effectuer un diagnostic anténatal de maladie génétique fiable et dépourvu de tout risque pour l'enfant à naître.

Le séquençage du génome humain et les grandes avancées de la génétique moléculaire ont permis d'identifier un nombre croissant de maladies génétiques, environ 5000 à l'heure actuelle. Pour une trentaine d'entre elles, un diagnostic prénatal est possible par prélèvement des cellules foetales du liquide amniotique ou des villosités choriales suivi de l'analyse moléculaire de leur génome. Malheureusement, l'acte invasif pour obtenir les cellules foetales n'est pas sans risque, pouvant déclencher une fausse-couche dans 1 à 3% des cas.

S'il est vrai qu'aujourd'hui on dépiste et on évite la survie de foetus anormaux,c'est au prix du sacrifice d'un nombre important de foetus sains. Sur 36 000 amniocentèses, cela fait, au minimum, 360 foetus sacrifiés par an. Après la légalisation de l'IVG et la reconnaissance du droit de la mère à décider de la naissance de son enfant, ce taux semble être accepté comme un "mal mineur", sauf que, - et la différence est de taille -, ces parents des 360 foetus ne veulent pas le perdre, leur bébé ! Quant à ceux qui considèrent le foetus comme un être humain à part entière, ils ne voient pas de progrès depuis l'époque romaine, il y a plus de 2000 ans, quand les nouveau-nés malformés étaient précipités de la Rupe Tarpea.

Un rêve a donc envahi les chercheurs quand, il y a environ 40 ans, il est apparu que des rarissimes cellules foetales franchissent la barrière placentaire et circulent dans le sang maternel. Ces cellules contiennent le génome foetal et pourraient permettre de dépister les maladies génétiques. Ce serait là une avancée spectaculaire et probablement le début d'une vraie révolution car la diffusion des progrès diagnostiques est beaucoup plus rapide, au niveau planétaire, quand il s'agit de tests sur simple prise de sang. Après les conquêtes historiques de la dissociation entre sexualité et procréation et entre conception et procréation1, nous aurions enfin celle, fondamentale, entre le choix de garder ou non notre propre enfant dont la souffrance est inscrite dans les gènes et le risque de le perdre alors qu'il n'est pas malade.

Je crois qu'il ne faut pas avoir peur de regarder nos horizons, ni de l'"eugénisme médical", sous prétexte que cela rappelle l'"eugénisme d'état" de triste mémoire. Comme le mentionne Bernard Debré2, "il suffit d'aimer l'homme, de respecter son choix et de le sauver encore et toujours. Ni plus ni moins". Si l'humanité est capable d'implémenter les règles éthiques de respect de l'homme et de sa dignité, alors "rien n'est à craindre" et, pour la première fois dans son histoire, elle aura la possibilité, et un moyen facile, d'améliorer ses gènes.

Dans la pratique, toutefois, plusieurs problèmes techniques s'opposaient à la réalisation de ce rêve : 1) les cellules foetales circulantes sont rarissimes, de l'ordre de une mélangée à 10 millions de globules blancs et 5 milliards de globules rouges par millilitre de sang, 2) elles sont de quatre types différents : lymphoïdes, myeloïdes, érythroïdes et épithéliales (trophoblastiques) et seulement les érythroïdes et épithéliales constituent la bonne cible pour le diagnostic prénatal car elles sont éliminées à l'accouchement, et 3) ces cellules foetales doivent être isolées sans être mélangées à aucune cellule maternelle, car le génome de la mère peut fausser l'analyse diagnostique réalisée sur le génome des cellules foetales.

Après plus de 20 ans de recherches acharnées et infructueuses, à la fin du siècle dernier le scepticisme était la règle dans ce domaine. "Les cellules foetales circulantes ? c'est le monstre de Loch Ness : tout le monde en parle, personne les a vues" entendait-on dans les congrès de génétique médicale.

Dans l'étude américaine, les chercheurs avaient développé des anticorps dirigés contre des antigènes des cellules érythroïdes et espéraient pouvoir ainsi isoler les cellules érythroides foetales. De façon décevante, ces anticorps isolaient des cellules érythoides maternelles et laissaient échapper une bonne partie des rarissimes foetales. Pour identifier les cellules foetales effectivement isolées, les chercheurs avaient limité leur étude à des femmes enceintes de foetus masculins ; dans ce cas le génome foetal porte le chromosome Y, absent dans les cellules maternelles et identifiable par la méthode FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Les résultats furent publiés à la fin de 2002 dans la revue spécialisée Prenatal Diagnosis ; 1292 femmes enceintes d'un foetus masculin avaient été testées : au moins une cellule foetale avait été identifiée dans seulement 41% de ces mères avec un taux de faux positif de détection de sexe foetal de 11%. Le travail montra la faillite de la méthode américaine et induit plusieurs équipes à délaisser le sujet, considéré comme "impossible".

En France, sur le campus "Necker-Enfants Malades", nous travaillions depuis 1995 à la détection de rarissimes cellules épithéliales tumorales circulantes et cherchions en 1998 à mettre au point une approche efficace pour les isoler intactes du sang des patients avec cancer. L'enjeu de cette nouvelle méthode était la possibilité de prévoir la survenue de métastases pour essayer ainsi de "sauver" le patient. J'avais proposé à une jeune biologiste de Florence, Giovanna Vona, arrivée en 1999 dans notre équipe pour appendre les techniques de biologie moléculaire, de travailler à l'idée un peu bizarre de "filtre" : l'isolement, à partir du sang, des cellules tumorales rarissimes par la taille. Le raisonnement "enfantin" était que les cellules du sang sont les plus petites de l'organisme, il devait donc être possible d'isoler "les autres" par la taille : seulement, personne n'y était jamais arrivé.

Trouver, en recherche, n'est presque jamais un hasard. On peut marcher sur la pépite d'or, mais encore faut-il croire au signal du détecteur et y croire assez pour s'acharner à creuser jusqu'à la dénicher. Autrement, c'est la détermination poussée à l'extrême, bien souvent au-delà du désespoir, qui fait trouver. Et la détermination vient de la motivation, voir de notre histoire personnelle. C'est ainsi que le cerveau, marqué par les yeux des patients avec cancer qu'on "n'a pas pu empêcher de mourir" va chercher, tel un chien de police "en mission", la voie pour aider, améliorer, sauver. A' la fin de 1999 la nouvelle méthode, appelée ISET pour Isolation by Size of Epithelial Tumor cells, était au point.

Nous avons très vite réalisé que la sensibilité de ISET est extraordinaire, arrivant à isoler une seule cellule tumorale mélangée à 10 ml de sang, c'est à dire 100 millions de globules blancs et 50 milliards de globules rouges ! De plus, ISET présente un avantage de taille: les cellules rarissimes ainsi isolées peuvent être étudiées pour identifier leur caractère tumorale et même leur génome (ADN) est accessible aux analyses génétiques. Coût du système bricolé : 15.000 Francs. Coût global du projet : environ 100.000 Francs.

L'article scientifique qui décrit la méthode ISET est soumis pour publication à la revue American Journal of Pathology en juin 2000 et sera publié la même année. Après la soumission, Giovanna part en vacances en Italie. En août, le coup de fil me frappe comme une foudre. Giovanna, 32 ans, m'appelle et me confie être atteinte d'un cancer du colon déjà métastasé au foie. Pas question d'attendre en Italie, elle veut venir en France pour se faire opérer et continuer le travail. On scelle à ce moment précis le pacte qui nous lie : cette maladie terrible, ce calvaire, restera un secret entre nous deux jusqu'à la fin et l'avancement de nos recherches sera notre "raison de vie". J'avais à l'époque un bagage de 27 ans de travail en recherche biomédicale, dont 13 en biologie moléculaire, c'était ma responsabilité de guider les recherches au succès et je ne voulais pas droit à l'erreur ni au retard. Nos âmes communiquaient, nous n'avions besoin ni de mots, ni de regards, ni de nous serrer la main. Ce qui était enfoui dans mon cerveau et contre quoi je voulais me battre était maintenant devant mes yeux et alimentait la rage et le désespoir des jours et des nuits de travail.

En 2001, il devient clair que le système ISET devrait pouvoir isoler du sang d'autres cellules rarissimes non sanguines : les cellules foetales circulantes, et plus particulièrement les plus recherchées, les cellules trophoblastiques. Dès que cette idée nous vient à l'esprit, une lumière et un frisson nous envahissent: nous allions pouvoir nous battre à la fois contre la mort des patients avec cancer et pour la vie des foetus tués de façon iatrogène !

Nous réalisons l'énorme chance d'avoir développé ISET dans un des lieux les plus prestigieux et qualifié en France pour le diagnostic des maladies génétiques, le campus Necker, et voulons croire à tout prix à la possibilité d'arriver à mettre au point une méthode fiable de Diagnostic Prénatal sur cellules foetales circulantes. Le projet est difficile et risqué, et présente des aspects techniques très pointus de biologie moléculaire à résoudre. Toutefois, rien peut désormais nous arrêter, ni la quantité de travail, ni la méfiance des uns ou le scepticisme, la dérision, parfois l'opposition des autres. Le Professeur Arnold Munnich, généticien, et le Professeur Yves Dumez, obstétricien, sont les premiers à "y croire" et à nous aider, suivis par le Professeur Vekemans. Sans eux, rien n'aurait été possible. Ils se montrent favorables à participer à l'étude et nous mettent en contact avec leurs collaborateurs, le Dr Jean Paul Bonnefont, le Dr Alexandra Benachi et le Dr Serge Romana. Ces collaborations de très haut niveau et notre détermination ont constitué toute la force qui a permis de doubler la compétition américaine, alors que la disproportion de moyens était abyssale. Notre "potion magique" était un mélange de motivation sans faille à se battre "pour la vie", d'excellence scientifique, et de volonté farouche de voir la France arriver en tête de la compétition.

En 2001, le Dr Christophe Béroud, généticien à Necker, rejoint notre équipe. Cette année, nous avons travaillé même le jour de Noël, mais le jeu valait la chandelle : notre article fut publié en 2002 dans la revue American Journal of Pathology, avant la publication de l'étude américaine, et montra que l'équipe de Necker pouvait isoler par ISET les rarissimes cellules trophoblastiques du sang maternel chez toutes les mères testées. L'article allait plus loin et décrivait également une stratégie moléculaire globale de Diagnostic Prénatal non invasif, valable à la fois pour les foetus de sexe masculin et féminin, alors que nos concurrents américains avaient ciblé uniquement, pour réduire les difficultés, les foetus masculins.

La méthode ISET comprend trois étapes :

  • isolement des cellules trophoblastiques par ISET à partir du sang
  • extraction des cellules suspectes d'être foetales, une par une, à l'aide du microscope équipé de laser Nikon
  • analyse comparative du génome des cellules microdissequées par rapport au génome du père et de la mère (ADN extrait à partir de quelque goutte de sang), ce qui permet de faire diagnostic de cellule foetale même si le foetus n'est pas masculin
  • recherche de mutation (diagnostic génétique) ciblée aux cellules avec génome foetal.

Il faut noter que le développement du Diagnostic Prénatal non invasif implique la mise au point d'une méthode génétique spécifique, adaptée aux cellules uniques isolées par ISET, pour chaque maladie génétique ciblée.

Giovanna, après trois interventions chirurgicales, ayant des métastases osseuses diffuses, bravait des douleurs atroces. Je l'ai prise un après midi dans les bras alors qu'elle allait tomber. Elle a enfin accepté que je l'accompagne chez elle. Nous savions toutes les deux qu'elle abandonnait le laboratoire pour toujours. Elle a ensuite regagné Florence. Sa voix au téléphone était toujours sereine, presque joyeuse : incroyablement, elle m'encourageait.

- Comment fais-tu, Giovanna ? je lui ai demandé un jour
- Je n'ai pas le choix – fut sa réponse

Elle partit tout doucement, malgré des douleurs terrifiantes, à l'aide des drogues de l'oubli. Elle est restée dans mon coeur, force mystérieuse et invisible qui ne cédera jamais.

Avec Christophe Béroud et Marc Karliova, médecin allemand venu apprendre les techniques de biologie moléculaire, en collaboration avec les équipes des Professeurs Munnich et Dumez, nous avons développé l'approche ISET pour le diagnostic prénatal de l'Amyotrophie Spinale que nous avons ensuite appliqué à 12 couples à risque d'avoir un enfant atteint. Le travail, publié dans la revue prestigieuse The Lancet en 2003, montre que des cellules foetales sont identifiées chez toutes les mères testées et que leur analyse moléculaire permet d'identifier, en aveugle (sans que nous ayons connaissance du résultat de la méthode invasive), les trois mères porteuses d'un foetus malade. Alors que, au niveau international, les autres équipes étaient encore au stade de rechercher une méthode pour isoler et identifier les cellules foetales circulantes chez les mères porteuses d'un foetus masculin, nous avions brûlé toutes les étapes, ayant appris à isoler très efficacement ces cellules rarissimes, à analyser leur génome pour démontrer d'abord leur nature foetale indépendamment du sexe foetal, et ensuite pour faire le diagnostic de maladie génétique : une première saluée par la presse.

Le Dr Ali Saker, obstétricien d'origine Syrienne, a ensuite rejoint notre équipe pour apprendre la méthode ISET et la cibler au Diagnostic Prénatal non invasif de la Mucoviscidose. La mise au point de la méthode moléculaire spécifique et son application à 12 couples à risque d'avoir un enfant atteint a demandé plusieurs années de travail. Les résultats, publiés en 2006 dans la revue Prenatal Diagnosis, montrent que l'approche ISET, réalisée en aveugle, a permis d'identifier, chez 12 couples à risque, le foetus atteint de Mucoviscidose, les 4 foetus sains et les 7 foetus qui sont porteurs de la maladie. Ceci confirme l'avancée de nos travaux et encourage à les poursuivre pour pouvoir les proposer au public.

Dans ce but, une étude de validation clinique de la méthode ISET-Amyotrophie Spinale est mise en place en 2005. Elle consiste à tester au moins 16 mères à risque d'avoir un enfant avec Amyotrophie Spinale qui acceptent de participer à l'étude, à la fois par la méthode invasive et par ISET. L'étude est réalisée en aveugle, c'est-à-dire sans que les résultats du test invasif soient révélés aux chercheurs. Elle sera terminée à la fin de 2007. Les résultats de la méthode ISET seront alors révélés et comparés à ceux de la méthode invasive : les généticiens auront ainsi tous les éléments décisionnels pour l'adoption de la méthode ISET à la place de la méthode invasive. Une étude similaire pour la validation clinique de la méthode ISET-Mucoviscidose a été mise en place en 2006 : les résultats sont attendus pour 2008.

Il nous reste à gagner le défi fondamental, celui que beaucoup de parents attendent avec impatience : la mise au point et validation de la méthode ISET pour le Diagnostic Prénatal non invasif de la Trisomie 21. En effet, pour cette anomalie chromosomique fréquente (un cas sur environ 800 naissances), les couples "à risque" ne sont pas identifiables à l'heure actuelle, et la possibilité d'offrir un diagnostic prénatal fiable "à toutes les femmes enceintes" par dépistage constituerait un progrès médical important. Techniquement, le projet présente une difficulté supplémentaire. En effet, il faut développer une méthode capable de détecter, au niveau des cellules individuelles (donc d'une quantité infime d'ADN : 4 picogrammes) non plus une différence qualitative, comme c'est le cas des mutations qui caractérisent l'Amyotrophie Spinale, la Mucoviscidose ou d'autres maladies génétiques, mais une différence quantitative (3 chromosomes 21 au lieu que 2), la séquence du chromosome supplémentaire étant identique à celle des deux autres.

Avec Marc Karliova nous sommes parvenus en 2005, au bout d'efforts majeurs, à mettre au point une approche très prometteuse. Il s'agit de l'application aux cellules uniques isolées par ISET de la méthode CGH (Comparative Genomic Hybridization). Toutefois, arrivés à ce point, nous étions bloqués par manque de financements. En effet :

  • la validation de cette méthode CGH pour le Diagnostic Prénatal non invasif de la trisomie est très coûteuse
  • la compagnie Metagenex, que j'avais fondé en 2001 pour lever des fonds et aider au développement et validation des méthodes ISET n'avait presque plus d'argent
  • la difficulté de trouver en France des financements pour la recherche reste grande et la demande que j'avais déposé en 2005 à l'Agence Nationale de la Recherche (ANR) pour ce projet avait été refusée

L'enjeu est majeur à la fois pour les parents du monde entier et pour la France : il s'agit d'être les premiers à développer une méthode fiable et non invasive pour le Diagnostic Prénatal de la Trisomie 21.

Marc Karliova, ayant obtenu un poste universitaire en Allemagne, a quitté notre équipe. Il fallait maintenir absolument dans le laboratoire la manualité de cette approche très sophistiquée que nous avions mise au point. Les financements de la compagnie Metagenex avaient permis, entre autres, de payer le salaire d'une ingénieur qui avait été formée à la méthode CGH sur cellules uniques et la location du microscope à laser qui est essentiel pour notre approche ISET.

En mars 2006 j'ai déposé une nouvelle demande de financement pour le projet Trisomie 21 à l'ANR, cette fois dans le cadre des appels d'offres ANR-RIB qui concernent les partenariats public-privé. Le partenariat proposé était celui de notre Laboratoire (Unité INSERM 807), des Laboratoires du Prof Munnich et du Prof Vekemans pour le côté "public", et de la compagnie Metagenex, pour le côté "privé".

En juillet 2006, la compagnie Metagenex, gérée par un nouveau manager, David Znaty, lève 2.7 millions d'Euros avec l'aide des Investisseurs Axa Private Equities et Banexi Ventures Partners. Cet apport est censé permettre la mise en place des validations cliniques pour le test ISET Oncologie et financer les recherches pour le test ISET Diagnostic Prénatal de la Trisomie 21.

L'heureuse nouvelle du financement du projet déposé à l'appel d'offres ANR-RIB, à la hauteur de 600 000 Euros, arrive en septembre 2006 et nous enthousiasme. Nous espérons enfin pouvoir atteindre le but principal de nos recherches : pouvoir proposer aux femmes enceintes un dépistage de la trisomie 21 sur simple prise de sang.

Malheureusement, tout est bloqué une nouvelle fois, et ceci non pas à cause des Laboratoires publics.

Au total, alors que nous avons mis au point une méthode susceptible, après validation technique et clinique, de permettre le diagnostic prénatal non invasif de la Trisomie 21, nos travaux sont arrêtés depuis 2005.

Ceci met en grave péril nos efforts et l'engagement de notre vie pour les atteindre. D'autre part, la recherche française dans ce domaine doit faire face maintenant à la compétition par des riches compagnies, une de Hong Kong et l'autre américaine, qui poursuivent les mêmes objectifs.

La collaboration de notre équipe avec celles des Professeurs Munnich, Dumez et Vekemans a eu la chance d'obtenir, sur un sujet aussi critique, une avance importante sur la compétition internationale alors que les moyens à notre disposition étaient largement inférieurs. Il ne faudrait pas que toutes ces énergies soient gâchées : chaque mois de temps perdu est une atteinte au développement de l'innovation dans notre Pays, un dommage à la France et à ses citoyens et un tort aux espoirs légitimes des futures mamans.


1. Hervé Chneiweiss, Jean-Yves Nau : Bioéthique avis de tempêtes. Les nouveaux enjeux de la maîtrise du vivant. Editions Alvik, 2003.
2. Bernard Debré : La revanche du serpent ou la fin de l'Homo sapiens. Edition Le cherche midi, 2005.


Modif. April 04, 2009, at 06:42 PM<br />(:addThis username="xa-4b5388e32c732dfe" btn="lg-share":)

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